基因组在几乎所有细胞中是稳定不变的，基因是遗传信息的携带者，而生物功能的真正执行者是蛋白质，蛋白质组与基因组相比具有以下特点：组成庞大而复杂、有相对独立的代谢过程、具有对生物机体内部外界因素产生反应的能力、存在着广泛的相互作用[1]。蛋白质组又是高度动态的，根据细胞的发育和生理状态的不同所表达的蛋白质在一刻不停地变化着，想要通过一种方法研究一个生物体、一个组织甚至一个细胞的全部蛋白质几乎不可能。因为细胞内蛋白质的表达丰度相差可能几个数量级，高丰度的蛋白质常常将低丰度蛋白质掩盖，致使一些低丰度蛋白质，特别是一些受体、信号转导和调控蛋白难以检测到。

    因此，蛋白质组学技术的发展应该能够使不同水平的蛋白质都能够同时分离和鉴定。

二维凝胶电泳

    二维疑胶电泳技术(2 dementional gelelectrophoresis,2 DE)是O’Farrell等在1975年首先提出的，它的原理，首先根据蛋白质等电点不同在pH梯度胶中等电聚焦(IEF)将其分离，然后按照它们分子量大小在垂直方向或水平方向进行十二烷基磺酸钠——聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)第二次分离。2DE可以将细胞或组织或体液样品内的绝大部分蛋白质分离开。2DE是蛋白质组学研究应用最早的核心技术，现在仍然是蛋白质组学最常用且最关键的分离技术[2-6]。

    虽然2DPAGE技术在过去的30年中得到了不断的应用和发展，但是仍有许多需要解决的问题，如对于低拷贝、极酸、极碱、过大过小、难溶蛋白质的分离及电泳图谱的重复性和分辨率等问题都需要进一步提高。

    最近发展了利用荧光染料标记的双向电泳技术即凝胶内差示电泳(differential ingelelectrophoresis，DIGE)。DIGE技术可以全面地观察到两种样品蛋白质表达间的差异。一个样品的蛋白质全部用荧光染料(Cy3)标记，而对照样品用激发波长不同而化学性质类似的另外一种荧光染料(Cy5)标记。两种标记过的样品混合到一起，在同一块胶上进行二维电泳分离。电泳好的凝胶采用不同波长的扫描，通过观察一个蛋白质点两种荧光密度的深浅或有无，可以得到有关特定蛋白质点的丰度变化、蛋白质的缺失或是否有新蛋白质出现等信息。DIGE技术对于研究对照组和处理组样品的差异蛋白质图谱具有很好的应用前景[7-8]。

    DIGE技术与传统的2DE方法相比，优点在于：重复性大大提高、蛋白质样品的差异表达更精确直观、动态范围更宽、染色时间短、荧光标记不会影响质谱分析结果。缺点是其标记方法只适用于含有赖氨酸的蛋白质；对于赖氨酸含量少的蛋白质的DIGE标记有一定的困难。因为只有一小部分蛋白质被标记，大部分蛋白质在Cy3、Cy5标记的谱图上看不到，所以未被标记的蛋白质可进一步通过荧光染料SYPR/Ruby染色确认。对于感兴趣的蛋白质也可以通过其经SYPRO/Ruby染色得到的谱图与经Cy3、Cy5标记的谱图进行比较而获得确认。

多维液相色谱

    多维液相色谱(multidimentional liquidchromatography)，即将样品在第一根液相色谱柱的洗脱液依次注入后续的色谱柱进行分离的液相色谱柱专用技术。这种技术可以根据样品组分的性质差别，选择具有最大分离效果的几种色谱分离模式组合(反向色谱、离子交换色谱、分子排阻色谱、亲和色谱或者毛细管电泳等)，对样品进行分离。样品中各组分以进样点为原点在多维的分离方向上展开。1987年，Giddings[9]指出，多维联用系统的总分辨率约等于各维分辨率平方和的平方根，总峰容量约等于各维峰容量的乘积，多维分离系统可以减少峰重叠，提高系统的分辨率和峰容量，为样品的定性提供更多的数据信息，它还具有分离速度快、重现性好、自动化程度高的优点。

    液相色谱与质谱联用是目前对复杂样品分析定性最受重视的分析手段之一。与传统二维凝胶电泳相比，多维色谱系统最突出的优点：1)快速、灵敏、便于自动化，能够满足蛋白质组学研究高通量的要求；2)可使全蛋白质组分分析时的歧视效应大大减小，多维液相色谱与质谱联用已经成为蛋白质组学分离技术的一个新的生长点。目前大多数液相色谱分离模式均和MS连用[10]，这种系统具有高峰容量、高灵敏度、分析速度快、易于实现自动化等优点。

同位素标记亲和标签技术

    同位素亲和标签技术(isotope codedaffinitytags,ICAT)原理是将样品和对照品分别用轻、重两种试剂标记，然后将两种样品混合，酶解、再经过链亲和素柱，使ICAT标记的肽片段吸附在柱上，将ICAT标记的肽段洗脱下来，经液相色谱-质谱分析，在质谱上可检测出表达程度不同的蛋白质，将所得的差别峰经进一步的串联质谱分析，数据库检索，进而鉴定出相应差异表达的蛋白质。

    利用ICAT联合多维液相色谱质谱技术可以进行差异蛋白质分析研究，可以较准确地鉴定不同状态细胞或组织中差异表达的蛋白质。David等[11]利用ICAT技术系统测定了来源密切相关的两种细胞膜蛋白的相对含量。Griffin等[12]利用ICAT技术，联合质谱技术，鉴定蛋白质水解后的肽段，鉴定了一些低丰度蛋白质。Michael等[13]在ICAT试剂基础上发明了磷酸化蛋白同位素亲和标签试剂，为研究和鉴定磷酸化蛋白的磷酸化位点提供了一条新途径。有学者在传统标准的ICAT技术基础上又改进而形成了固相同位素标签技术，其原理是将ICAT试剂与玻璃珠结合，使之固相化，通过固相捕捉和释放等化学反应过程，LC/MSMS分析蛋白质的肽段[14]。目前这种方法的缺点在于所采用的试剂仅对于含有半胱氨酸残基的蛋白质有效[15-17]，因为ICAT仅能和含有半胱氨酸残基的蛋白质反应，但含有半胱氨酸残基的蛋白质的量只占蛋白质总数的80%，另外20%不含半胱氨酸残基的蛋白质无法用ICAT技术鉴别;因此所得蛋白质的量是一个相对值，还不能准确地反映细胞内蛋白质的真正含量；每一个ICAT试剂分子的分子量为442 D，相对少于7个氨基酸残基的肽段，分子量过大，所以会影响小肽段的鉴定；在标记过程中，高浓度SDS可影响ICAT试剂与蛋白质或肽段结合，ICAT试剂与碱性蛋白质结合可能改变其等电点，特别是等电点超过8的蛋白质受这种影响会更大。

    美国应用生物公司开发了一种同时对4种样品进行绝对和相对定量研究的方法-同位素标记相对和绝对定量(isobarictags for relative and absolute quantity, iTRAQ)技术。该技术采用的试剂可与氨基酸N端及赖氨酸侧链连接的胺标记同重元素(isobaric)。在质谱图中,一种iTRAQ试剂标记的不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。相应在串联质谱中,信号离子表现为不同质荷比的峰,因此,根据波峰的高度及面积,可以得到蛋白质的定量信息[18]。在蛋白质研究技术中，DIGE和ICAT已被广泛应用,仍然具有其局限性[19-20]。iTRAQ作为一种新的蛋白质绝对和相对定量技术,具有很好的精确性和重复性,且弥补了DIGE及ICAT的不足,被广大科研人员所接受。有学者应用iTRAQ及ICAT蛋白定量技术及多维液相色谱串联质谱研究子宫内膜癌组织,发现了9种标记蛋白[21]。

    相信随着蛋白质组学研究的进一步深入和研究技术的不断发展，在不远的将来一定会发现适合于各类蛋白质分析的试剂。

蛋白质芯片

    蛋白质芯片(protein chip)即蛋白质阵列或蛋白质微阵列，又称“高通量微量蛋白质识别技术”与基因芯片类似，把数以万计的蛋白质高密度排列在固相支持物表面，通过探针蛋白特异性的捕捉样品中的靶蛋白，洗去未结合的其他蛋白质，经相应的检测系统即可对靶蛋白进行定性及定量分析。蛋白质芯片的探针蛋白可以选用抗体、抗原、受体和酶;芯片载体可以采用玻璃板、纤维素膜、多孔凝胶块玻片、微孔板等;检测方法可以采用如基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDL/TOF)以及在它基础上改进后实行的表面加强的激光解析电离化飞行时间(SELDITOF)、电喷雾质谱分析、表面等离子共振技术(SPR)等生物传感器直接检测法，也可以采用蛋白质标记技术，如荧光物质或同位素标记待检测蛋白质后，用标准扫描仪、照相技术(CCD)、激光扫描系统等检测芯片信号，通过专门的软件进行图像分析。蛋白质芯片分类，按材质可分固相表面型芯片、微孔型芯片、毛细管电泳型芯片、液相载体型芯片、细胞组织型芯片等;按功能可分检测型芯片和功能型芯片。

    蛋白质芯片和表面增强的激光解吸离子化质谱技术(SELDIMS)相结合应用最常见，可用于寻找差异表达的蛋白质，原理是将不同生理状态的样品和同一蛋白质芯片结合，洗去未结合的蛋白质，然后用SELDIMS分析结合的蛋白质，找到差异表达的蛋白质，为下一步的临床诊断提供生物化学方面的依据。美国Petricoin等[22]用蛋白质芯片技术从卵巢癌病人的血清中筛选出5个标记蛋白。Wu等[23]利用SELDI蛋白质芯片技术鉴定来自同一病人的两种头颈部鳞状细胞癌细胞株中蛋白质的差异表达，发现头颈部鳞状细胞癌发生和转移的重要分子，并以这些分子作为生物标记分子，用于头颈部鳞状细胞癌的临床诊断。近年来，利用蛋白质芯片技术寻找疾病生物标志物的研究层出不穷[24-26]。

    蛋白质芯片检测技术在分析蛋白质组研究中不仅实现了快速、高效、高通量，而且能鉴定蛋白质间的相互作用。利用该技术可以比较疾病和健康状态的细胞或组织的蛋白质，找出差异蛋白质，确定疾病标志物。也可分析疾病不同阶段蛋白质变化，进而发现疾病不同时期的蛋白质标志物，为临床诊断提供量化指标。Li[27]对169例血清进行检测，其中乳腺癌103例，正常人41例，其他乳腺病25例，结果发现3个潜在新肿瘤标志物，该方法灵敏度93%，特异性91%，提示该方法可用于筛选乳腺癌生物标记物。DAI等[28]用SELDI技术成功筛选出15个肺癌标志分子，为肺癌诊断技术的发展提供了关键性的基础;美国洛克菲勒大学艾伦·戴蒙德艾滋病研究中心张林琦等[29]采用SELDI，对艾滋病患者、艾滋病病毒感染但长期存活者和正常人血样进行了比较分析，确定了3个控制艾滋病病毒复制的蛋白质。Rosty等[30]使用SELDITOFMS对胰腺癌患者及其他胰腺疾病患者的胰液及血清中的微量表达蛋白质进行测定，在中发现一个分子量为(16.57 kD)的标志蛋白质。Poon等[31]用蛋白质芯片测定肝癌和慢性肝病人，发现250余种蛋白质表达明显不同;孙玲等[32]研究者采用蛋白质芯片-飞行时间质谱仪分析精液不液化患者，发现了精浆中相关蛋白质群。

    SELDI蛋白质芯片在蛋白质组学研究中优点在于：1)不会破坏蛋白质;2)分析蛋白质不需溶解和染色，且针对性更强;3)适用于分析组分复杂的生物样品，可直接用粗生物样品如血清、尿、体液等，检测灵敏度高(可达1 fmol);4)所需样本量小;5)鉴定所获得的信息量大(包括相对分子量、含量、等电点、糖基化位点、磷酸化位点等信息)，并可发现低丰度、小分子量的蛋白质;6)自动化、高通量、耗时短、重复性好;7)简单易行;8)可以分析2DPAGE无法分析的蛋白质(包括疏水性蛋白质，PI值过高或过低的蛋白质);9)可用于MALDI所不能进行的蛋白质定量分析。这些优势使SELDI蛋白质芯片技术特别适于筛选疾病标志物，用于发现与疾病相关的一种蛋白质或生物标记物或一组蛋白质，从而提供疾病诊断的最佳组合指标。

    虽然该项技术与其他技术相比有其固有的优势，但是仍然存在着不少问题：1)对不同分析样本设计的检测芯片，理论上可以将样品所有相同性质蛋白质捕获，但实际应用中仍有少量蛋白未能捕获;并非所有的蛋白质都能同等被显示，分子量低于30 kD的蛋白质能被很好检测，高于此分子量的蛋白质其敏感性明显下降。2)蛋白质动力学方面的影响，如血清蛋白质组是高动力性的，其中各蛋白质浓度相差巨大，高丰度蛋白质的出现干扰了低丰度蛋白质的定量和定性检测，因此面临一个将高丰度蛋白通过有效的预先分馏分离手段改善低丰度蛋白的检测问题。3)蛋白质峰强度某些情况下受蛋白质与芯片结合力强弱的影响，也很难依此进行蛋白质的准确定量。4)该系统都为人工操作，从样本的储存、处理，缓冲液的配制，参数的设定等，各实验室均不完全相同，难免影响检测结果。5)标记物蛋白质的仍然依靠传统的方法浓缩或分离，依靠MS/MS等可靠性及准确性更高的装置鉴定，目前有此条件的单位并不多；6)检测结果分析可获得蛋白质含量并分子量资料，但不能给出C端，N段序列和蛋白质构型；7)所用检测芯片之间或阅读器之间有时还存在结果差异;芯片上每个位点结合的蛋白质量仅约200个分子，远低于实际估计值，对该技术的掌握和使用者的经验也有待积累。另外，该芯片及设备和分析软件等费用均较昂贵，且分析质谱需要大量后续工作支持等都限制了该技术的进一步推广应用，但是有理由相信，在科技飞速发展的今天，这些问题定会被致力于此的科研人员解决，使之摒弃缺点，淋漓尽致的发挥其在分子生物学研究中的优势。

噬菌体展示技术

    噬菌体展示(phage display)最早是由George于1985年[33]提出的。最先构建的噬菌体多肽或抗体展示文库则始于1990年[34]。噬菌体展示的基本概念是将外源蛋白质或多肽的基因表达产物与噬菌体衣壳蛋白融合，并在其表面展示，同时将其遗传密码信息整合到个体噬菌体的基因组中。这个技术的最大优点是直接将可现的表达型与其基因型联系在一起，再利用其配体的特异性亲和力，将所感兴趣的蛋白质或多肽挑选出来。噬菌体表面抗体库技术是将全套抗体基因克隆入噬菌粒表达载体，使全套抗体分子片段被呈现表达于噬菌体蛋白质Ⅲ上，用全套抗体库筛选差异蛋白质时，先用目的细胞对噬菌体表面全套抗体库进行筛选，称为“阳性选择”，再用阳性选择得到的噬菌体抗体对对照细胞进行“阴性选择”，去除识别目的细胞与对照细胞共同的抗原的噬菌体抗体，从而得到仅能识别目的细胞特有的差异蛋白质的抗体，据此抗体可以确定或捕获差异蛋白质。

    目前噬菌体展示技术用于抗体的制备、多肽及蛋白质和酶的制备。近几年，该技术被作为一种新工具用于多肽和蛋白质药物的发现与研制、蛋白质与蛋白质的相互作用及蛋白质与DNA相互作用的研究、蛋白质结构和功能的研究以及基因治疗药物的定向传递等多方面的研究。巨立中等[35]应用噬菌体展示技术筛选出肝炎病毒核心蛋白反式激活基因HCTP4启动子DNA的结合蛋白;杨艳杰等[36]用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到了HBVSPⅡ的结合蛋白，分析了该蛋白的编码基因，为进一步研究HBV的复制、转录、调节机制开辟了新的途径。谢建平等[37]应用噬菌体展示技术寻找微生物基因组中适合通量药物筛选靶点的功能未知基因;王德发等[38]用噬菌体展示技术筛选出抗乳腺癌单链抗体。

    噬菌体展示技术从建立到现在，在生命科学研究的许多领域都得到广泛的应用[3940]，尤其是在抗原的表位分析和抗体的筛选中得到了很多令人满意的实验结果。

蛋白质组学在航天

医学研究中的应用前景

航天特因环境对人体心血管功能、骨骼肌肉系统及内分泌免疫系统的影响已然成为航天人面临并亟待解决的首要问题，无论从整体水平还是细胞分子水平，都进行了或正在进行着大量的研究。以失重对心血管影响研究为例，多项研究结果表明,失重后心血管系统的变化与立位耐力不良的发生有着密切联系[41];模拟失重后家兔的股静脉顺应性增加、管壁组织结构也发生相应改变[42]，但其中的作用机理仍不是十分清楚。这些现象的产生都不是偶然的，必然有其内在本质改变。从分子生物学的角度来看，蛋白质结构或功能的改变是一切外在生理或病理变化的本质，从这个意义上来讲，进行航天蛋白质组学研究对于揭示航天特因环境下生理及病理变化的实质以及研究对抗性药物有着重要的指导意义。

随着现代科学技术的不断发展，高科技产品不断涌现，无论是旧方法的改进，还是新方法的出现，都将对蛋白质组学研究产生积极的推动作用。相信在不远的将来，蛋白质组学技术会不断走向成熟，蛋白质组学也将完成对人类生命活动深层次的诠释。

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广东华南新药创制中心 作者:  刘军莲,李勇枝,高建义,盖玉清,王 静,薛春美，辛冰牧 发布时间:  2012/5/22 0:00:00 浏览量:  3255